Шведские и финские биологи разработали методику, позволяющую пометить любую молекулу РНК или ДНК и определить их общее количество, не пересчитывая все молекулы в растворе, что значительно увеличит точность всех современных технологий чтения и копирования переносчиков генетической информации.
Юсси Тайпале (Jussi Taipale) из Каролинского университета в Стокгольме (Швеция) и его коллеги опубликовали «рецепт» этой технологии и итоги ее первой проверки на практике в статье в журнале Nature Methods.
Тайпале и его коллеги создали несколько типов уникальных идентификаторов молекулы, при помощи которых можно определить происхождение молекулы и ее копий.
Одной из таких «бирок» выступал случайно составленный фрагмент ДНК, которые ученые присоединяли к обрывкам анализируемой цепочки. Второй вид идентификатора содержится в самой молекуле — ученые просто разбивают ее на короткие цепочки нуклеотидов, строительных «кирпичиков» ДНК, и считывают произвольный участок в каждом сегменте.
Ученые проверили свою методику следующим образом. Они смешали равное количество геномной ДНК мальчика, страдающего синдромом Дауна, и его матери и разбили смесь ДНК на части химическим путем. Биологи выделили образец, в котором содержался неполный набор фрагментов из каждого генома, и попытались восстановить кариотипы — набор признаков всего набора хромосом матери и ее ребенка при помощи компьютера.
В статье отмечается, что классический метод подсчета фрагментов ДНК не показал того, что половина из них была получена от мальчика с тремя 21 хромосомами — основным признаком синдрома Дауна.
С другой стороны, уникальные идентификаторы в «обрывках» ДНК дали правильные результаты — повышенное количество копий 21 хромосомы и небольшая концентрация женской Х-хромосомы, которая есть у всех мужчин только в одном экземпляре. Ученые отмечают, что точность подсчета молекул ДНК растет с увеличением глубины секвенирования и количества фрагментов в анализируемом образце.
Затем биологи сравнили методы мечения. Лучшими были признаны короткие метки на концах фрагментов ДНК, поскольку такой вариант «бирок» можно применять не только для анализа этих молекул, но и для подсчета РНК за один эксперимент.
При помощи этого метода ученые подсчитали число разных фрагментов информационной РНК, выделенной из клетки мушки-дрозофилы.
Биологи использовали оригинальную молекулу РНК для сборки ее копии в виде ДНК, разбили «слепок» на фрагменты и присоединили к ним участки-метки из 10 случайно выбранных нуклеотидов. После этого они 25 раз размножили полученные обрывки ДНК и подсчитали количество фрагментов при помощи собственной и основной существующей методики.
Классический способ оказался довольно неточным: у 8% генов число обрывков не соответствовало их реальному количеству после деления оригинальной молекулы на фрагменты. Уникальные же идентификаторы гораздо лучше справились с этой задачей — общая точность прочтения составила 99%.
Исследователи полагают, что совместимость с большинством современных технологий секвенирования ДНК позволит безболезненно добавить такие метки в арсенал современной молекулярной биологии. Кроме того, методика применима для подсчета и наблюдения за другими типами биологических молекул — белков, частиц вирусов.
|